非洲豬瘟病毒實時熒光 PCR 檢測試劑盒說明書【獸藥名稱】通用名：非洲豬瘟病毒實時熒光 PCR 檢測試劑盒商品名：無英文名稱：African Swine Fever Virus Real-time PCR Detection Kit漢語拼音：Feizhouzhuwen Bingdu Shishiyingguang PCR Jianceshijihe【主要成分與含量】產(chǎn)品組份規(guī)格（48 頭份/盒） 樣品裂解液3 管（4 mL/管）熒光 PCR 反應(yīng)液1 管（1.2 mL/管）陽性對照1 管（500 μL/管）陰性對照1 管（500 μL/管）說明書1 份【作用與用途】 用于豬全血、血清、淋巴結(jié)、脾臟、肌肉等樣本中的非洲豬瘟病毒的檢測。【用法與判定】1用法1.1樣品采集1.1.1全血：直接取動物新鮮血液 200 µL 備用。1.1.2組織樣品：取脾臟、淋巴結(jié)、肌肉等組織約 1 g，剪碎后取 0.1 g 進(jìn)行充分研磨，隨后加入 1.5 mL 生理鹽水進(jìn)行勻漿，將此樣本轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 離心管中，8000 g 離心 2 min， 取上清液備用。1.2樣品處理1.2.1取需要數(shù)量的離心管（需設(shè)置陽性對照及陰性對照），均加入樣品裂解液 190 µL；1.2.2分別加入采集的待檢樣品（全血、組織樣品等）、陽性對照、陰性對照各 10 µL，充分混勻；1.2.3瞬時離心，取上清液備用。1.3PCR 操作步驟1.3.1取出試劑盒，從中取出實驗所需試劑，融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著的液體；1.3.2在各 PCR 管中分別加入 20 μL 熒光 PCR 反應(yīng)液，轉(zhuǎn)移至樣本準(zhǔn)備區(qū)；1.3.3分別加入 1.2.3 步驟獲得的上清液 5 μL，混勻，瞬時離心，轉(zhuǎn)移至檢測區(qū)；1.3.4將各 PCR 管放置在儀器樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序；1.3.5按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。 體系25 μL 反應(yīng)體系信號通道FAM 通道采集熒光信號。PCR反應(yīng)條件階段條件循環(huán)數(shù)預(yù)變性95℃ ：3 min1PCR95℃ ：10 s4060℃ ：20 s2結(jié)果判定2.1實驗成立條件2.1.1陽性對照：Ct 值≤30，有明顯指數(shù)增長，呈典型的 S 型曲線。2.1.2陰性對照：Ct 值＞38 或無 Ct 值，無明顯指數(shù)增長期和平臺期。2.2判定標(biāo)準(zhǔn)2.2.1陽性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值≤33，有明顯指數(shù)增長，表明樣本中檢測出該病毒。2.2.2可疑：樣本檢測結(jié)果 Ct 值在 33~38 范圍，應(yīng)對樣本進(jìn)行復(fù)檢。如重復(fù)實驗結(jié)果 Ct 值仍在 33~38 范圍，有明顯指數(shù)增長，則判定為陽性，否則為陰性。2.2.3陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值＞38 或無 Ct 值，表明樣本中未檢測出該病毒。【注意事項】（1）實驗前請仔細(xì)閱讀本試劑盒說明書，嚴(yán)格按操作步驟執(zhí)行。（2）所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲存，詳細(xì)信息見試劑標(biāo)簽。（3）為了避免交叉污染，請盡可能在無核酸酶的環(huán)境下操作，并將試驗過程分區(qū)進(jìn)行（樣本準(zhǔn)備區(qū)、擴(kuò)增檢測區(qū)等）。（4）配制 PCR 反應(yīng)體系時應(yīng)盡量避免氣泡產(chǎn)生，擴(kuò)增前應(yīng)檢查反應(yīng)管是否蓋緊，以免反應(yīng)液泄漏污染儀器。（5）本試劑盒可搭配標(biāo)準(zhǔn)核酸提取方法進(jìn)行樣品檢測，Ct 值等判定參數(shù)不變。（6）為保證實驗結(jié)果準(zhǔn)確，樣品應(yīng)為新鮮采集，2-8℃運(yùn)輸，長途運(yùn)輸請使用干冰。（7）所有試劑應(yīng)避免反復(fù)凍融。【貯藏與有效期】 ﹣20℃冷凍避光貯存，有效期為 12 個月。【規(guī)格】 48 頭份/盒